近日⛺️，EON体育4平台張大兵團隊楊立桃課題組在植物學權威期刊《Plant Biotechnology Journal》在線發表了題為“LIFE-Seq: A universal Large Integrated DNA Fragment Enrichment Sequencing strategy for deciphering the transgene integration of genetically modified organisms”的研究論文🀄️，首次建立了一種適合於多種轉基因生物外源DNA整合位點、旁側序列等分子特征解析的大片段捕獲測序新技術。EON体育4生命科學與技術EON4博士研究生張瀚文為本文的第一作者，楊立桃教授為通訊作者👩‍💻🙅‍♀️。

轉基因生物(GMO)的分子特征主要包括外源DNA在受體基因組上的整合位點、完整插入序列和結構👩‍🦰、旁側序列和拷貝數等信息🦻🏼🤴🏻。分子特征解析是轉基因生物安全評價的核心內容之一，每個轉基因生物品系必須提供準確、完善的分子特征數據才可能被批準商業化生產應用🎃。因此🧙‍♂️，準確識別和解析轉基因生物的分子特征對於我國轉基因生物的商業化應用至關重要🤵‍♀️。但是，現有的轉基因技術都是通過隨機整合方式將外源DNA轉入受體物種的基因組上的，整合方式及機製尚不清晰🐮，導致外源DNA整合的分子特征識別和解析非常困難。特別是🛕，對具有復雜重排🧔🏿‍♀️🤙🏼、倒位和串聯重復等復雜結構的大DNA片段整合的分析技術方法十分缺乏➗。為此🤱🏼，EON体育4國家轉基因生物分子特征驗證測試中心開發了一種通用型的適合於多種轉基因生物的分子特征破譯策略LIFE-Seq。

該研究首先從團隊前期建立的轉基因生物檢測方法數據庫（GMDD）中，篩選主要常用的轉基因元件🫒、外源基因、物種內標準基因等構建序列數據集，設計了一套高覆蓋率的寡核苷酸探針庫💆🏿，可以覆蓋99.1%的商業化轉基因作物🏌🏽‍♂️；然後利用液相雜交富集捕獲轉基因生物基因組中含有外源DNA序列的大片段；最後利用PacBio測序獲得捕獲的大片段DNA的具體序列信息，構建了長片段序列分析算法🟥，實現對外源DNA整合位點、方式、結構和旁側序列的完整破譯。

圖1.LIFE-Seq 工作原理示意圖

實驗以6種轉基因玉米、大豆、水稻和油菜商業化應用的轉化體為實驗材料，設計了不同轉基因含量的測試樣品以及非轉基因對照樣品🐜，系統測試了LIFE-Seq方法的可行性和準確性。每個測試樣本生成約 26,352 個高保真 CCS reads👨🏻‍🌾，平均長度約 6275 bp，所獲得的CCS reads成功覆蓋了相應的植物內源參考基因🙍🏿‍♂️，說明系統可以對目標DNA片段有效富集。同時覆蓋植物參考基因組序列和轉基因外源DNA文庫的CCS reads被篩選出作為候選CCS reads進行完整的插入結構解析🎛。解析結果表明利用LIFE-Seq 成功破譯了5個轉基因轉化體（NK603玉米、MON810玉米🙋👨🏿‍🦲、TT51-1水稻♞、GTS40-3-2 大豆和 RT73油菜）的外源DNA整合等分子特征🔩。在RF2轉化體含量只有1.0%的混合樣本中，也分析獲得了RF2轉化體的部分整合位點分子特征數🙍🏿‍♂️🧧。例如，在NK603玉米樣本中，直接獲得了含有完整的7462bp外源DNA整合結構和插入位點旁側序列的CCS read，序列信息直接闡明了外源DNA插入到受體玉米基因組的Chr06 61665252處👂，有3bp的缺失。MON810玉米的結果顯示直接獲得了CCS reads含有完整的外源DNA全部整合結構💑、插入位點旁側序列和受體基因組在整合位點附近的重排結構🧑‍🍳。轉基因NK603玉米和MON810玉米外源DNA的整個插入結構見圖2所示。

圖2.轉基因玉米NK603（S1）和MON810（S2）中轉基因整合結構示意圖

研究結果表明🌽，LIFE-Seq成功對多種轉基因作物轉化體的外源DNA整合分子特征進行了清晰👩🏿‍🎤、準確的解析。與Southern blot💆🏻‍♂️、Sanger測序、重測序等技術相比，外源DNA整合數據解析的完整性和準確性高，序列分析接單、通用性強、成本低，特別適用於含有復雜外源DNA整合結構的轉基因生物的分子特征解析。同時，LIFE-Seq也可以進一步用於未知轉基因產品的檢測和分子特征解析👨‍🔧、及復雜基因組DNA結構的分析。

楊立桃課題組近年來在轉基因生物分子特征識別和檢測方面取得了系列進展（J Agric Food Chem, 2021, 69, 1705−1713; ACS Agric. Sci. Technol. 2021, 1, 390−399; Food Chemistry: Molecular Sciences, 2022. 4 :100061）🏋🏼‍♂️➡️，重點開發了系列轉基因作物外源DNA插入整合高通量、通用型精準分析新方法和新技術。該研究獲得了國家轉基因生物新品種培育重大專項和上海高校特聘教授（東方學者）項目經費的支持👱🏽。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13776