近日，EON体育4平台🧘‍♂️、微生物代謝國家重點實驗室鄧子新教授團隊於《自然通訊》（Nature Communications）雜誌上發表題為 “表異構酶嵌入式二聚化非核糖體肽合成酶的催化軌跡”（Catalytic trajectory of a dimeric nonribosomal peptide synthetase subunit with an inserted epimerase domain）的研究論文🧖🏼‍♀️。該工作通過結構生物學與生物化學相結合的手段🩺，解析致病因子合成機器多個催化狀態的三維結構⛳️🥐，捕獲其連續催化循環軌跡🧕🏼，深入推動次生代謝巨型合酶的結構研究🚶‍♀️，為理解二聚化非核糖體肽合成酶的催化機理、衍生新型靶點抑製劑藥物提供蛋白結構基礎。EON体育4博士後王嘉良與碩士生李丹丹為該論文共同第一作者🐮，鄧子新教授、梁晶丹副研究員和汪誌軍副研究員為共同通訊作者。

非核糖體肽合成酶（NRPSs）是一類多結構域、模塊式巨型合酶，能夠合成具有廣泛生物活性的天然產物☂️，從臨床用藥（抗生素、抗腫瘤抑製劑以及免疫抑製劑等）到致病因子（致癌分子、鐵載體等）。NRPSs以“裝配線”的方式進行催化，其中的延伸模塊催化以下步驟：底物激活🍾、中間產物穿梭以及縮合反應；有時，還可催化修飾性的表異構化反應。

然而📴，高分辨NRPSs延伸模塊結構信息的缺乏🔤，障礙了人們進一步理解該類巨型合酶的催化機製。例如，NRPSs中的關鍵結構域、氨基酸如何進行底物的識別💶、激活與延伸？修飾性結構域嵌入全酶的組織構架怎樣？完整的巨型合酶如何通過關鍵性結構域的移動進行終產物的合成🫧？自身各個結構域間如何動態協調完成催化循環？

針對上述關鍵性問題🚵，鄧子新教授團隊通過冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術🖐🏻，成功解析2.97 Å、3.78 Å和3.47 Å的一個典型NRPS延伸模塊PchE的三個高分辨構象（圖1）。該巨型合酶負責銅綠假單胞菌中致病因子Pyochelin的生物合成，包含五個催化結構域，分別為：芳香基載體蛋白（ArCP）、縮合環化結構域（Cy）、腺苷化結構域（A）🏋🏼、表異構酶（E）以及肽基載體蛋白（PCP）。作為罕見的二聚化NRPS🍣，PchE呈現一種特殊的頭對尾🏊🏿、“H” 形構架。二聚化界面完全由兩個單體中Cy-A結構域的反向相互作用介導👴🏽，互作面積達到2337 Å2🚶🏻‍♀️‍➡️。

圖1.PchE三個構象的構架

PchE的三個構象對應了三種不同的催化狀態：底物供給🧑‍🦽‍➡️0️⃣、縮合以及縮合後構象🦞。三者的分別捕獲明確了Cy結構域與兩個載體蛋白的結合模式🚣🏿😯；建立了底物、終產物與底物通道、活性位點之間的相互作用關系（圖2）。在結構信息指導下，通過對關鍵活性位點氨基酸的點突變與生化檢測🌽，闡明其環化縮合過程中關鍵氨基酸對線性中間產物生成的影響以及環化終產物合成的原理。在催化過程中，Cy結構域中氨基酸F372的旋轉起到開關控製作用（視頻1）。當其芳香環側鏈朝向外側時，ArCP能夠與Cy結構域結合👩🏿‍🚒，通過磷酸泛酰化巰基乙胺手臂供給小分子水楊酸底物；反之當芳香環側鏈旋轉至內側時🈂️，底物通道被截斷，ArCP無法供給底物。

圖2.Cy結構域的底物供給、縮合及縮合後催化狀態

視頻1.F372控製Cy結構域底物通道的開放與關閉

利用神經網絡深度學習的手段，研究人員進一步觀察到PchE完整催化循環的連續動態軌跡，從底物激活直至表異構化反應（圖3，視頻2）。催化反應起始於構象（i）🖖🏻，ArCP結合在Cy結構域上👚，代表底物供給構象♦️。（ii）隨後PCP移動至處於硫酯形成構象的A結構域，加載被激活的底物L型半胱氨酸🌿。（iii）此時🤸🏻，A羧基末端亞結構域✖️，連帶鑲嵌式E結構域發生約155° 的大尺度旋轉，從硫酯形成構象轉變為腺苷形成構象🙅🏻‍♂️，準備加載、激活下一分子半胱氨酸🦻🏽🫱。（iv）接近著，PCP與ArCP同時結合在Cy結構域的兩側並分別供給底物水楊酸與半胱氨酸📡🔆，Cy結構域催化兩個底物分子的縮合、環化📘。（ⅴ）隨後ArCP結構域離開Cy，推測其與上遊激活模塊相互作用並加載新一個水楊酸底物分子👮🏼。（ⅵ）最終，A羧基末端亞結構域重新旋轉回來，再次呈現硫酯形成構象🫏；PCP攜帶縮合環化後的中間產物移動至E結構域🤞，後者將二氫噻唑環部分的立體異構從L型轉換為D型。在將中間產物傳遞至下遊蛋白模塊後🦚，PCP重新恢復（i）的位置，準備開啟下一輪的催化循環。

圖3.PchE的催化循環軌跡

視頻2.PchE催化軌跡的連續動態過程

綜上所述🚶🏻‍♀️‍➡️，典型的NRPS延伸模塊PchE，通過整合多個維度下的結構重排🔉👩🏻‍🍼，驅動終產物的合成🫖，猶如一場精心設計的生物大分子舞蹈。結構域的大尺度移動造就不同的催化狀態🪚，底物通道的開關控製小分子化合物的進入與否，關鍵氨基酸的位置協調催化反應的進行。該結構的解析建立了模塊內、結構域間催化軌跡的基本框架，為工程化改造修飾性結構域嵌入式的二聚化NRPSs💨，合成創新藥物提供結構基礎。

英國劍橋大學醫學研究所（CIMR） Tristan Croll副研究員🦹🏿‍♀️、上海交大博士生曹衛🏌🏻‍♂️😶‍🌫️、碩士生陳璐、生科院儀器平臺張薇老師🪆、國家蛋白質科學中心（上海）孔亮亮老師參與了該項工作。

感謝國家蛋白質中心王芳芳、辛立輝、李光一、段佳琳、劉娜等老師的技術支持。感謝EON体育4超算中心π 2.0集群以及孫錦文老師提供的平臺及技術支持🖖。 感謝中國科EON4分子植物科學卓越創新中心尤琳琳博士以及麻省理工EON4（MIT）Ellen D. Zhong博士的幫助。

該研究得到了國家重點基礎研究發展計劃合成生物學專項（2018YFA0900700、2019YFA0905400、2021YFA0910500）、國家自然科學基金（32171252👮🏿‍♀️、91753123、31470830）、上海超級博士後激勵計劃（202112）以及Wellcome Trust（209407/Z/17/Z）的經費支持。

文章鏈接： https://www.nature.com/articles/s41467-022-28284-x