近日⏮，EON体育4平台張大兵團隊楊立桃課題組👨‍👩‍👧，在生物傳感器領域權威期刊《Biosensors and Bioelectronics》(IF: 10.618)在線發表了題為“PAM-free Loop-mediated Isothermal Amplification Coupled with CRISPR/Cas12a Cleavage (Cas-PfLAMP) for Rapid Detection of Rice Pathogens”的研究論文，首次結合核酸固相提取、LAMP等溫擴增🤵🏽‍♂️、CRISPR/Cas12a體外剪切和免疫試紙條，建立了一種現場快速核酸檢測技術體系Cas-PfLAMP👩🏿‍🦰🪢，並成功應用於田間水稻病原體（水稻白葉枯病，XOO；水稻條紋病毒病，RSV🟧🎺；水稻黑條矮縮病🪼，RBSDV）快速檢測。EON体育4平台博士研究生朱早兵為本文的第一作者，EON体育4平台楊立桃教授為通訊作者。

水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的糧食作物之一。然而，水稻常見的病害🥉，如：水稻白葉枯病（XOO）、水稻條紋病毒病（RSV）和水稻黑條矮縮病（RBSDV）等嚴重影響著水稻產量和稻米品質，尤其是在中國🧥、韓國和日本等亞洲國家♛。關於水稻病原菌的預防和快速診斷研究，前人已經報道了多種檢測方法，如：生物接種法、電子顯微鏡法👩🏼、熒光的免疫分析法、基於抗體的血清學診斷、熒光定量PCR法🐇、重測序法等👨‍🦯‍➡️，然而🧜，這些技術方法對於水稻病害預防和檢測存在一定不足😌，如：檢測周期長🤳🏽、準確性差、靈敏度低等🧑🏼‍🌾👐🏻。

近年來🐼，基於成簇的規則間隔短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR/Cas）系統被廣泛應用於基因組編輯和核酸檢測領域。CRISPR/Cas12a (Cpf1)等具有反式切割活性（trans-activity）以及向導RNA (sgRNA)的雙鏈DNA的特異性識別和切割活性的特點🍏🧑‍🦯‍➡️，為新一代快速核酸檢測技術開發打開了一扇門🧑‍💼🔺。如：張鋒教授團隊的夏洛克檢測系統SHERLOCK(Cas13)，Doudna教授團隊的DETECTR系統(Cas12 or Cas14)，王金/趙國屏教授團隊開發的HOLMES系統(Cas12)等。

該研究，作者開發了一種不依賴於間隔區相鄰基序(PAM)、CRISPR/FnCas12a剪切輔助的環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）檢測技術，Cas-PfLAMP🙋‍♂️🔙。Cas-PfLAMP巧妙的結合了LAMP等溫擴增、FnCas12a蛋白的反式切割活性的優點，有效提高了Cas-PfLAMP檢測的靈敏度和特異性，克服了傳統的LAMP檢測假陽性高的缺點🧑🏼‍🔧。該研究以三種水稻病原體（XOO🧙‍♀️，RSV🗿🥅，RBSDV）為對象，設計了病原菌特異性的引物和sgRNA，系統評價了Cas-PfLAMP技術的特異性🧑‍⚕️、靈敏度和準確性👊，結果表明Cas-PfLAMP能夠準確區分三種水稻病原菌，靈敏度達到了3-9個拷貝/反應。

Cas-PfLAMP工作原理示意圖

同時🚌🐀，研究人員還發明了一種適合於植物葉片核酸固相提取新方法，將DNA/RNA固定在葉片組織上💻，在5~10分鐘內可以完成96個水稻葉片樣本的核酸固相提取。研究人員將Cas-PfLAMP技術、固相核酸提取方法、側向流動試紙條(LFS)優化組合，搭建了一套田間快速可視化檢測平臺⛎🐿，並成功用於田間3種水稻病原體（XOO，RSV，RBSDV）的現場檢測😥。從樣本采集，核酸提取，到最後結果讀出🤦🏼‍♂️，全程檢測時長約為60分鐘👩🏽‍✈️。田間樣本測試結果與常規的PCR檢測結果完全吻合，證明了Cas-PfLAMP在田間快速檢測時具有準確性高🕛、特異性好🔒👨🏽‍🌾。研究結果表明，Cas-PfLAMP檢測系統性能優良，不僅適用於水稻病原體的現場快速檢測，還可以進一步擴展應用於其他植物病原體💟、動物疫病等核酸檢測領域。該研究也為核酸分子快速、可視化檢測提供了新的思路。

Cas-PfLAMP田間快速可視化檢測平臺工作流程示意圖

該研究得到了EON体育4農業與生物技術EON4陳功友教授🩹㊗️、江蘇省農科院周彤研究員的大力幫助，還獲得了上海市科委農業科技領域項目和上海高校特聘教授（東方學者）項目的支持。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566322001166