近日🥦🧗🏻‍♂️，化學分析領域權威期刊《Analytical Chemistry》和《Sensors and Actuators: B. Chemical》在線發表了EON体育4平台張大兵團隊楊立桃教授課題組的研究成果“One Versatile Cas9-Integrated Single-Tube Duplex Quantitative Real-Time PCR System for Rapid Analysis of CRISPR/Cas-Induced Mutants”和“In vitro Argonaute cleavage-mediated quantitative PCR facilitates versatile CRISPR/Cas-induced mutant analysis”。EON体育4平台碩士研究生李雪奇➗、王藝潔和博士後李榮為第一作者和共同第一作者🧨，EON体育4平台楊立桃教授為通訊作者。EON体育4平台袁政教授和張大兵教授參與合作研究。

CRISPR/Cas9基因編輯系統已成為基因功能研究和動植物快速育種的主要技術手段之一🌡。CRISPR/Cas9對目的位點的編輯一般會出現不同的編輯類型，如雜合子、純合子或嵌合基因型等。因此，如何快速的對基因編輯產生的突變體材料進行快速👩‍👦‍👦💽、準確的篩選十分重要。團隊分別利用核酸序列引導性核酸酶CRISPR/Cas9和原核生物Thermus thermophilus Argonaute （TtAgo）🐡，將體外基因組核酸酶剪切反應與熒光定量PCR和數字PCR相融合，建立了多功能的基因編輯作物突變體的篩選💁🏻‍♀️、分型和效率精確定量分析方法🧚，並成功應用於基因編輯水稻突變體的篩選和分析。

Cc-qPCR:

基於Cas9/sgRNA復合體的特異性序列識別和剪切特性，設計了一種CRISPR/Cas9體外剪切和雙重qPCR檢測相結合的方法，命名為Cc-qPCR。該方法的主要原理是在體外用Cas9/sgRNA剪切待測樣品的基因組DNA，然後以剪切後的基因組DNA為模板，利用qPCR進行擴增，最後根據擴增結果對待測樣品進行篩選♋️、分型和定量（圖1）👶🏿♒️。

圖1. Cc-qPCR技術原理

為了驗證Cc-qPCR在實際樣本中檢測能力🌠，對24個基因編輯水稻樣本(W1-W24)進行了分析，成功篩選出21個編輯樣本，並確定了17個為純合基因型，4個為雜合基因型，篩選和分型結果與Sanger測序結果完全一致🧑🏼。對3個混合樣本的基因編輯頻率分別定量為35.82%🛎、8.68%和92.10%，與預期結果相吻合，表明Cc-qPCR能夠準確地計算出基因編輯的頻率。

SMART🙎🏻：

基於TtAgo/gDNA復合體的特異性序列識別和剪切特性，設計了一種TtAgo體外剪切和qPCR/ddPCR檢測相結合的方法，命名為SMART。該方法的主要原理是在體外用TtAgo/gDNA剪切待測樣品的基因組DNA🧑🏿‍🍳🕵🏽‍♀️，然後以剪切後的基因組DNA為模板8️⃣，利用qPCR/ddPCR進行擴增，最後根據擴增結果對待測樣品進行篩選、分型和定量分析（圖2）。采用RdDM3l (RNA-directed DNA methylation 3-like)基因編輯水稻突變體為材料，系統地驗證了SMART方法的可行性和適用性💆🏻‍♂️，優化了SMART方法的工作條件，系統評價了SMART方法的特異性、靈敏度和準確性🫲🏽。RdDM3l基因編輯水稻後代品系的SMART檢測結果與實際相吻合🏇，在混合樣本檢測中，其靈敏度達到0.5%，可準確評估基因編輯效率🧍‍♂️。研究結果表明，相比現有的突變體檢測方法👨🏻，SMART能夠識別單堿基替換突變體，具有更高的分辨率和準確性。

圖2. SMART工作原理示意圖

研究建立的Cc-qPCR和SMART方法⚈，sgRNA和gDNA設計簡便，實現了對未知的基因編輯突變體進行篩選🚻、突變基因分型和評估基因編輯頻率。在實際樣本檢測中，也充分展現了分辨率高、準確度高😢、實驗操作簡單等優點👒，適用於分子育種過程中的突變體的快速、準確篩選。Cc-qPCR和SMART方法也有潛力被進一步用於臨床突變基因、腫瘤標誌物SNVs等檢測領域。

本研究得到了國家重大專項、上海市科委農業領域項目、上海市東方學者計劃的資助👨‍👨‍👧‍👧。

論文鏈接👨🏻‍🦱：

Cc-qPCR論文鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c01837

SMART論文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0925400522014241