近日🧚🏽，EON体育4平台/微生物代謝國家重點實驗室的吳更教授團隊與武漢大學王連榮、陳實教授團隊合作，闡明了鏈黴菌等細菌通過DNA上的磷硫酰化修飾激活細菌中SspE蛋白的核酸酶活性，對侵入細菌的噬菌體DNA進行缺刻👩‍🔬，從而抗噬菌體侵染的結構和功能機理💃🏼。這項研究闡明了細菌如何通過DNA磷硫酰化修飾激活SspE蛋白來實現對噬菌體侵染的抵禦功能，加深了人們對於DNA磷硫酰化修飾的功能的認識🧅。該研究成果以“A coupled recognition-activating nicking mechanism underlying the DNA phosphorothioate-sensing antiphage defense barrier by SspE”為題發表在《Nature Communications》上。吳更與王連榮、陳實教授為共同通訊作者🧑‍🦲。本文是吳更團隊自2018年Nature Communications上發表的細菌識別DNA硫化修飾的結構機理🚾、2020年Nature Microbiology上發表的II型DNA硫化修飾的SspB和SspE結構🆖、2020年mBio上發表的II型DNA硫化修飾的SspA結構、2022年mBio上發表的I型DNA硫化修飾的DndE結構的延續和擴展。

DNA磷硫酰化修飾包括兩種類型：由dndABCDE基因簇編碼的蛋白介導的雙鏈I型修飾和由sspABCD基因簇編碼的蛋白介導的單鏈II型修飾。SspE是由sspABCD基因簇近旁的sspE基因編碼的一個核酸酶👨🏼‍🏫，長度為700-800氨基酸，由有GTPase活性的N端結構域（NTD）和有缺刻核酸酶活性的C端結構域（CTD）組成👳🏼‍♀️。

首先，這項研究通過解析鏈黴菌SspE的CTD結構域的2.7埃分辨率晶體結構和全長SspE蛋白的3.4埃分辨率晶體結構，發現SspE的NTD和CTD結構域分別形成獨立折疊的三級結構🅾️，NTD和CTD之間由一段較短的loop連接🦹‍♂️，而NTD和CTD之間沒有很緊密的結合➰。SspE的NTD含有DGQQR motif👩‍💻，識別並水解GTP。Ssp的CTD含有HNH motif，可以把共價閉環（covalently closed circular）DNA缺刻為開環（open circular）DNA👿🧑🏿‍🎨，將SspE-CTD上的HNH motif進行突變會使得其失去對噬菌體侵染的抵禦功能🙍‍♀️。

然後，該研究通過分子對接計算與定點突變體的GTPase酶活性實驗，發現SspE通過NTD結構域表面上的一個較為疏水的結合口袋識別細菌磷硫酰化修飾DNA，而對這個硫化DNA結合口袋上的氨基酸殘基進行突變會破壞SspE的GTPase酶活性與對於噬菌體侵染的抵禦功能。

接著，該研究通過非變性凝膠電泳遷移實驗☠️，發現SspE的CTD結構域可以與噬菌體DNA結合，而將SspE-CTD上一個保守的🧏、帶正電荷的凹陷表面上的重要殘基進行突變會破壞SspE與噬菌體DNA的結合，並會使得SspE失去對噬菌體侵染的防禦功能🔸。而且，SspE的CTD對DNA的結合依賴於其NTD對於GTP的水解。

最後🤰，有意思的是💿，該研究發現R100E突變會使得SspE失去GTPase酶活性與對DNA的缺刻酶活性💇🏻，然而R100位點並不在GTPase酶活性位點或DNA缺刻酶活性位點上。於是🧑🏽‍🚀，本研究解析了SspE-R100E突變體的3.48埃分辨率晶體結構，發現與野生型SspE相比，SspE-R100E突變體的CTD結構域朝向NTD結構域整體移動了2.6-3.9埃的距離，這表明SspE存在兩個結構域之間相對運動所導致的構象變化。通過熒光共振能量轉移實驗證實了對細菌磷硫酰化修飾DNA的結合以及對GTP的水解確實會讓溶液中的SspE蛋白產生構象變化✒️♓️。

圖🚡：細菌硫化修飾基因組DNA激活SspE的核酸酶活性，對噬菌體DNA進行缺刻切割，以抵禦噬菌體侵染的機理

論文鏈接👨‍🦯‍➡️：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34505-0