近日👩‍🏭，EON体育4平台🧎、微生物代謝國家重點實驗室鄧子新團隊合作於《自然通訊》（Nature Communications）雜誌上發表題為 “聚酮合酶的碳-氮鍵形成”（C-N bond formation by a polyketide synthase）的研究論文💃🏼。上海交大博士後王嘉良、上海佶凱星生物科技有限公司汪小傑、上海交大碩士李希希🤌🤹🏼、國家蛋白質科學中心（上海）孔亮亮、上海交大碩士生杜澤乾和博士生李丹丹為該論文共同第一作者。上海交大林雙君教授🍣、石婷研究員、鄧子新教授、汪誌軍副研究員和梁晶丹副研究員為共同通訊作者。

該工作通過組合分子遺傳學、結構生物學、生物化學和分子動力學模擬等多種技術手段，鑒定並重構鈣黴素合成途徑中聚酮合酶CalA3催化的C-N鍵形成現象🤡，解析CalA3與底物、產物的高分辨復合物三維結構，深入推動次生代謝巨型蛋白質機器的生物化學與結構研究，為理解聚酮合酶新穎的C-N鍵形成機理、衍生新型藥物提供理論基礎🎖。

聚酮合酶（PKSs）是自然界中一系列強大的多功能酶👧🏽，能夠合成具有廣泛生物活性的天然產物，包括：抗生素，降膽固醇藥💬，抗腫瘤藥以及免疫抑製劑。由於其具有功能多樣、結構復雜等特點🫁，探究PKSs的基本催化機製一直是微生物天然產物合成🧘🏿‍♂️，進而衍生新型藥物的研究焦點之一😢。

通常情況下，聚酮合酶遵守著相同的基本合成原理：催化C-C鍵的形成。然而，在抗生素鈣黴素合成途徑的聚酮鏈釋放步驟👐🏼，存在一種潛在的、未被鑒定的C-N鍵形成現象。關鍵的科學問題亟待進一步回答🧍‍♀️：（1）哪個酶負責催化C-N鍵的形成？該酶整體組織架構怎樣🈹，與其家族成員有何異同？（2）經典的形成C-C鍵的聚酮合酶如何催化C-N鍵的形成👷🏼‍♀️？（3）關鍵結構域、活性位點氨基酸如何進行底物的識別🚘、縮合以及聚酮鏈終產物的釋放？

針對上述關鍵性問題🤦🏿，研究人員首先通過體內敲除實驗，論證了聚酮合酶CalA3負責催化鈣黴素聚酮鏈釋放步驟中C-N鍵的形成。隨後運用冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術🧑🏿‍🦳，成功解析3.38 Å的CalA3高分辨結構（圖1）。CalA3整體呈現“∞”型的二體構架，分為上、下兩個部分。上半部分“結構區”🚣🏻‍♀️，包含DH-KR（脫水酶-酮還原酶）結構域🙍🏻，下半部分“催化區”，包含DD-KS-AT（對接-酮脂酰合酶-乙酰轉移酶）結構域。

圖1. 聚酮合酶CalA3的整體構架

結構高度對稱的CalA3上👨‍🍳、下兩個區域緊密相互作用，互作面積達到~2842  Å²（圖2）。DD結構域呈現水平、垂直的兩種截然不同的構象；AT、DH、KR結構域由於缺失活性位點氨基酸、或底物通道被堵塞、或輔因子結合序列丟失等原因，無法執行其應有的功能。它們組成了一個分子量巨大的“蓋子”，以非酶促的方式起到穩定整個蛋白質結構的作用。

圖2. 結構域間的相互作用以及非酶結構域的特征

CalA3真正的催化活性隱藏在KS結構域裏（圖3）🏟。通過體外重構成功鑒定了KS結構域催化聚酮鏈模擬底物SNAC-N1與輔因子3-HAA（三羥基鄰氨基苯甲酸）之間的縮合反應，核磁共振確定了形成C-N鍵或水解並被釋放的兩個終產物的化學結構；點突變測活鎖定了關鍵的活性位點氨基酸C197-H332-H372催化三聯體。

圖3. CalA3 KS結構域的結構與功能

為深入探究CalA3-KS的C-N鍵催化機製，通過分子動力學模擬對催化過程進行了初步的預測🐠；運用冷凍電鏡進一步捕獲了CalA3與兩種終產物的高分辨復合物結構（圖4）🕑，最終揭示了CalA3-KS的精確催化機製🛀🏿：在聚酮鏈進入KS的底物通道後🤸🏻‍♂️，C197對其硫酯鍵發動親核攻擊，形成酰化狀態🧓🏿。H332從輔因子3-HAA的氨基上獲取一個氫🩳，作為廣義堿再次發動親核攻擊，最終形成C-N鍵並釋放終產物或通過水解反應釋放終產物。此外🎑，在形成碳四面體中間產物時，H372、K367💥、L437和L439巧妙地穩定了輔因子3-HAA🧏🏼‍♀️，起定位作用👕🚀。

圖4. CalA3 KS結構域的催化機製

CalA3緊致並高度對稱的整體構架與其家族的其他PKSs差異巨大。通過人工智能AlphaFold2預測了合成雷帕黴素、FK-506以及兩性黴素的16個PKSs的完整結構（圖5）。與CalA3相反，這些PKSs通過結構的動態搖擺、創造非對稱的催化腔體↙️，實現上述免疫抑製劑和抗生素的生物合成。

圖5. CalA3與功能性聚酮合酶的構架對比及預測

該研究得到了國家重點研究發展計劃、國家自然科學基金、國家博士後科學基金以及上海市超級博士後激勵計劃的經費支持。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-36989-w