近日，EON体育4平台微生物代謝國家重點實驗室鄧子新團隊康前進研究小組於國際權威期刊《自然·通訊》（Nature Communications）雜誌上發表題為“Insertion sequence transposition inactivates CRISPR-Cas immunity”的研究論文🟧。上海交大博士研究生盛勇和王珩瑜兩位同學為該論文的共同第一作者。上海交大康前進副研究員、白林泉教授與鄧子新教授為共同通訊作者🧑🏻‍🏫。該研究還得到了林雙君教授⇨、陶美鳳教授🙎🏻‍♀️、丁偉特別研究員、唐滿成特別研究員和上海農業科EON4吳瑩瑩副研究員的大力支持🚁👨🏽‍⚕️。

該工作首先通過綜合應用生物信息學🤥、分子生物學、遺傳學和基因組學等多種技術手段，揭示了細菌如何利用插入序列（insertion sequences, ISs）在遺傳防禦與有益外源基因獲取之間進化的權衡。在長期的生物進化長河中🦿，CRISPR-Cas免疫系統被認為是廣泛存在於細菌和古菌中的一種適應性免疫系統⛰，可以有效保護宿主免受噬菌體和其他可移動元件的入侵🗡。然而，從進化的角度來看，CRISPR-Cas免疫系統卻是一把“雙刃劍”。一方面，它可以抵禦外來遺傳物質的入侵，但同時也會限製有益外源基因的獲取🪸，在一定程度上阻礙了細菌在脅迫環境中的適應性進化。

為了研究細菌如何應對CRISPR-Cas免疫系統所帶來的不利影響，通過對CRISPRCasdb數據庫中所有的CRISPR-Cas系統進行了系統分析🍎，發現了眾多天然的CRISPR-Cas屏障被IS轉座所破壞（圖1），推測了這一現象可能與有益外源基因的獲取相關。隨後，研究人員通過一系列分子生物學與遺傳學實驗在實驗室條件下成功模擬了CRISPR-Cas免疫系統與基因水平轉移之間的進化權衡關系⚗️。實驗結果表明，宿主菌株在經歷抗生素脅迫的巨大壓力下🤹，IS元件通過轉座至cas基因，實現宿主菌與帶有protospacer序列的外源抗生素耐藥質粒的鳳凰涅槃以及宿主菌在抗生素存在的環境中得以永生。

圖1. IS元件轉座至CRISPR-Cas系統

為了進一步研究IS轉座特性，研究人員利用具有單個效應蛋白的type II (SpCas9) 與type V (FnCpf1) CRISPR-Cas系統在大腸桿菌中構建了一套高效的IS元件捕獲系統（圖2）🎺☂️。該系統能夠選擇性地捕獲和分析轉座至cas基因的IS元件，為解析IS轉座至CRISPR-Cas系統及其對細菌適應性進化的影響提供了有力工具🌞。為了進一步探索IS元件轉座至cas基因的誘因，研究人員對SpCas9-HF1蛋白的RuvC與HNH結構域分別進行了單突變與組合突變🚵，獲得了三種具有不同切割能力的蛋白突變體𓀙。這些突變體包括對靶標鏈進行單鏈切割的SpCas9-HF1 (D10A)、對非靶標鏈進行單鏈切割的SpCas9-HF1 (H840A)以及僅結合🧑‍🍼，不切割的SpCas9-HF1 (D10A & H840A)。通過大量的質粒侵染實驗及PCR驗證🧑🏿‍🌾，研究人員發現只有當SpCas9-HF1蛋白對染色體進行雙鏈DNA斷裂時💧，才會誘發IS元件轉座至cas基因（圖2）。

圖2. 基於CRISPR-Cas建立高效的IS元件捕獲系統

接著，研究人員基於密碼子的簡並性，對Cas核酸酶編碼序列進行了三輪的迭代突變，使其DNA序列盡可能地規避IS元件識別的熱點motif🧑🏽‍⚖️。然而，令人意想不到的是，即使對核酸酶編碼序列進行了重構🪂，仍然以IS1與IS10為主要的轉座類型。通過對這兩個元件的識別序列進行系統的比較分析💾，發現了正是由於這兩個元件在靶標序列識別上呈現的巨大寬泛性潛能，才使得它們成為破壞CRISPR-Cas免疫系統的主要“武器”。

接著👨🏻‍🌾，研究人員在IS元件捕獲系統中，異源整合了三種修復能力不同的NHEJ（non-homologous end joining）修復系統。他們發現，盡管IS的轉座頻率有所下降，但轉座事件仍然發生。這一結果表明🖌，原核生物可能無法單獨依靠NHEJ系統完全修復CRISPR-Cas系統引發的DNA損傷🧖🏽‍♂️。進一步凸顯了IS元件在驅動菌株對環境適應性中的重要地位✌🏼。最後🏊，研究人員通過組合大量的生物信息學工具對整個NCBI數據庫中古菌、細菌與病毒中IS元件的分布進行了系統分析。結果表明🦻🏽，IS元件廣泛存在於細菌與古菌中，且各IS家族的拷貝數存在很大差異🌚。IS元件的廣泛分布意味著它們在不同宿主中可能發揮著關鍵功能🕚，通過參與宿主的適應性進化過程，從而推動宿主基因組多樣性和適應性演化。為了更深入地理解IS元件在宿主進化中的作用，研究人員還探究了IS元件與其他原核生物防禦系統的相互作用🙆🏻‍♀️😝。有趣的是，通過系統的篩查，發現IS1與IS10轉座到除了CRISPR-Cas系統以外的12種不同的防禦系統中🤽🏼‍♀️，例如限製性修飾系統與基於環狀寡核苷酸的抗噬菌體信號系統等（圖3）🧖🏿‍♂️🏋🏼。這意味著IS元件可能通過幹擾宿主的遺傳防禦系統，從而增加宿主獲取外源有益基因的能力，並促進其自身的適應性進化。

圖3. IS1與IS10元件轉座至多種不同的原核生物遺傳防禦系統