近日，國際知名期刊《ACS Catalysis》在線發表了EON体育4平台戴少波課題組的研究成果“Multifaceted Role of the Substrate Phosphate Group in Transketolase Catalysis”。EON体育4平台長聘教軌副教授戴少波❔，德國哥廷根大學Kai Tittmann教授為論文的共同通訊作者，EON体育4平台博士後柳誌永和博士生肖城良為論文第一作者。EON体育4平台林雙君特聘教授為論文提供了寶貴意見🔁。

磷酸基團是能量分子ATP和代謝途徑中間體化合物的通用基團，而大自然為什麽選擇磷酸基團，一直是學術界關註的焦點問題。轉酮酶（TK）是磷酸戊糖途徑和卡爾文循環中的關鍵酶，可逆性催化供體磷酸酮糖到受體磷酸醛糖的2碳單元轉移🛏。轉酮酶反應機理可概括為：（1）供體底物X5P與輔酶ThDP的共價結合；（2）底物C3-OH的去質子化導致C2-C3鍵斷裂和第一產物釋放；（3）烯胺中間體與受體底物R5P反應形成下一個共價中間體S7P-ThDP💇🏼‍♀️；（4）S7P-ThDP共價鍵斷裂和產物S7P釋放（圖1）🤞🏼🩷。

圖1. 轉酮酶的反應機理

底物的磷酸基團通常不直接參與酶催化，但在底物結合和識別中發揮重要作用。為了理解底物磷酸基團在轉酮酶催化中的作用，EON体育4平台分析了磷酸化底物(X5P和F6P)和去磷酸化底物的晶體結構特征。其中，hTK與木酮糖5-磷酸形成X5P-ThDP共價中間體結構（圖2）🥌🥷🏼，磷酸基團與周邊殘基相互作用；去磷酸基團後🪲，該加合物在C2-C3鍵裂解🌜，形成DHEThDP中間體，DHE部分與活性位點殘基如His77𓀒🤭、H110🚵🏽‍♂️、Gly123和Gln428形成氫鍵（圖3）🚌。通過分析捕獲的DHEThDP中間體的鍵長/鍵角和構型💺，發現C2-C2α鍵（1.35Å）明顯短於典型的C-C單鍵（1.51Å），但與典型的C-C雙鍵（1.34Å）非常相似。其次🕺🏿，這種鍵與噻唑環不在統一平面內，表現出約13°的平面外畸變。前期研究表明，Breslow中間體具有高度反應性，可以很容易地質子化、脫水或氧化。當與天然底物反應時，Breslow中間體不會在TKs中積累，而是作為與酮糖底物的共價偶聯物保持在“穩定儲存”狀態。這可以最大限度地降低副反應，可能是控製碳陰離子/烯胺中間體在酶催化中反應性的一種策略👚。基於NMR進行了反應中間體分析，發現反應平衡已經從對天然底物觀察到的供體-ThDP共價中間體轉移到DHEThDP烯胺中間體👨‍👦。

圖2👨‍⚕️：hTK與木酮糖5-磷酸形成X5P-ThDP共價中間體結構（PDB: 4KXV）

該研究表明TK供體底物的磷酸部分是轉酮酶催化中物理扭曲的共價中間體穩定的關鍵。底物磷酸基團在TK催化中有兩個未被認識的作用——將底物ThDP中間體穩定在高能狀態，及在缺乏醛糖受體的情況下防止反應性烯胺中間體的形成，從而保證受體交換的“門控機製”（圖4）

該研究工作得到了EON体育4啟動經費和國家自然科學基金的支持。

戴少波課題組長期招收酶學👩🏿‍🏫，化學生物學和合成生物學方向博士後🤮，感興趣可電郵聯系📿：sdai@sjtu.edu.cn

論文鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.3c04543